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    17羥孕酮Elisa試劑盒是如何進行細胞的凍存與復蘇

    點擊次數:224次 發布時間:2017-07-19

    17羥孕酮Elisa試劑盒為了防止因污染或技術原因使長期培養功虧一簣,考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異,有時因寄贈、交換和購買,培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室,的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時,細胞內的酶活性均己停止,即代謝處于完全停止狀態,故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵,在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內,水晶呈針狀,極易招致細胞的嚴重損傷。
     
    1.  細胞的凍存 
    為避免污染造成的損失,zui小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化,需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前,細胞應該特性化并檢查是否污染。
    有幾種普通培養基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養基,成分可能如下:
    ◆包含10%甘油的完全培養基,
    ◆包含10%二甲基亞砜(DMSO)的完全培養基,
    ◆50%細胞條件培養基和50%含有10%甘油的新鮮培養基,
    ◆50%細胞條件培養基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養基。
    對于無血清培養基,一些普通的培養基成分可能是:
    ◆50%細胞條件無血清培養基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養基,或
    ◆包含有7.5%二甲基亞砜和10%細胞培養級BSA的新鮮無血清培養基。
     
    (1)懸浮細胞
    ●計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長期。以大約200~400 g離心5分鐘沉淀細胞,使用移液管移去上清到zui小體積,不要攪亂細胞。
    ●以1×107到5×107細胞/ml密度,在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞,或者以0.5×107到1×107在無血清培養基中,再次懸浮細胞。
    ●分裝進凍存管,將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內開始冷凍步驟。
    ●細胞以1℃/分鐘進行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉移到液氮中貯存。
     
    (2)貼壁細胞
    ●使用分離試劑從基層分離細胞,分離時盡可能溫和,使對細胞的損傷減少到zui小。
    ●在完全生長培養基中,再次懸浮分離細胞,確定有活力細胞數。
    ●以大約200 g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到zui小體積,不要攪亂細胞。
    ●以5×106到1×106細胞/ml密度,在凍存液中懸浮細胞。
    ●分裝進凍存管,將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內開始冷凍步驟。
    ●細胞以1℃/分鐘進行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉移到液氮中貯存。
     
    2.  凍存細胞的復蘇 
    凍存細胞較脆弱,要輕柔操作。凍存細胞要快速融化,17羥孕酮Elisa試劑盒并直接加入完全生長培養基中。若細胞對凍存劑(DMSO或甘油)敏感,離心去除凍存培養基,然后加入完全生長培養基中。
     
    (1)直接鋪板方法
    ●取出貯存細胞,37℃水浴中快速融化。
    ●直接用完全生長培養基鋪板細胞。1 ml凍存細胞使用10~20 ml完全生長培養基。進行活細胞計數,細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。
    ●培養細胞12到24小時,更換新鮮的完全生長培養基,去除凍存劑。
     
    (2)離心方法
    ●取出貯存細胞,37℃水浴中快速融化。
    ●把1到2 ml凍存細胞加入到大約25 ml完全生長培養基,輕輕混勻。
    ●以大約80x g離心2到3分鐘。
    ●棄去上清。
    ●在完全生長培養基輕輕再次懸浮細胞,并且進行活細胞計數。
    17羥孕酮Elisa試劑盒細胞鋪板,細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。

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